免疫荧光实验——iPSC-derive神经元的体外神经毒性检测

如今神经毒性检测主要是依赖活体动物实验,不仅有伦理问题,而且通常非常昂贵并且十分耗时。当需要大规模的测试化合物的时候就不太合适了。因此,高通量的体外的神经毒性测试就显得十分必要了,而且可以使用人源的细胞直接进行试验,试验结果的实用性也更佳。但是,到目前为止,人源干细胞诱导的神经元并没有适合进行这类试验的特质,试验时间较长,批次间差异大,并且有收到伦理和一些法律的制约,使得这种细胞都不太适用于做大规模的体外测试试验。近来,市面上出现了商用的人源iPSC-derive神经元细胞,重复性好,可以用来做这类的体外神经毒性试验。

荷兰的科学家使用人源iPSC-derive神经元细胞做了免疫荧光染色试验,作为高通量进行体外的神经细胞毒性检测的预试验。由不同供应商提供的人源iPSC-derive神经元细胞混合培养能够形成不同(激活型或抑制型)神经元共培养的样本。
 
ALTEX. 2016 Mar 24. doi: 10.14573/altex.1510091
Is the time right for in vitro neurotoxicity testing using human iPSC-derived neurons?
Tukker AM1, de Groot MW1, Wijnolts FM1, Kasteel EE1, Hondebrink L2, Westerink RH1.
 
一、实验材料
1)细胞: iCell® Neurons NRC-100-010-001Cellular Dynamics international
          CDI iCell® AstrocytesCellular Dynamics international
          HIP neurons (GSC-4312, MTI-GlobalStem)
          DOPA.4U® neurons (Axiogenesis, Cologne, Germany)    
2)培养基:Complete iCell Neurons Maintenance Medium (with 2% iCell Neurons Medium Supplement) supplemented with laminin (10 μg/mL)
3)试剂: Poly-L-Ornithine ([PLO] 0.01%
4)培养耗材:µ-Slide 8孔腔室载玻片,ibiTreat底部处理 (ibidiGermany80826
 
二、实验方法
一)载玻片包被
① 每孔加入300μ的  0.01%Poly-L-Ornithine 溶液
② 室温孵育60分钟
③ 吸除所有液体并小心用PBS冲洗5-10分钟,即可开始使用
二)免疫荧光实验
1)铺细胞:
iCell® Neurons 每孔铺100000个细胞
iCell® Neurons/CDI iCell® Astrocytes共培养,每孔铺66000个细胞
HIP neurons 每孔铺100000个细胞
DOPA.4U® neurons 每孔铺52000个细胞
DOPA.4U® neurons/iCell® Astrocytes共培养,每孔铺48000个细胞
 
2)加入约300μl/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液,静置15分钟
3)加入300μl 1% Triton® X-100 PBS 溶液通透3-5分钟
4)加入300μl 2% BSAPBS溶液封闭20分钟
5)依次加入一抗,二抗进行免疫荧光染色后,冲洗小室并加入封片液进行显微镜观察(图二)。
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图二:图示铺细胞,固定,清洗,染色步骤。
 
三、实验结果
 
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图三:iPSC-derive神经元的免疫荧光染色结果。不同种类的人源iPSC-derive神经元使用β(III)tubulin(绿色)和GFAP(红色),用来区分神经元和星型胶质细胞(HIP® neurons, 左上;DOPA.4U® neurons,左下;iCell neurons,右上。) Human iCell 神经元用vGAT (绿色vGluT (红色)确定抑制或激活突触(右下)。细胞核使用DAPI染色(蓝色)。

 

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