伤口愈合/细胞划痕实验新方法-如何划出笔直均一的划痕

  

前言
     伤口愈合实验是体外研究细胞迁移的一个有用的实验。原理是人为的在铺板的单层细胞中制造一个空白的无细胞的地带,然后对这个无细胞地带的边缘的细胞进行观察;这些边缘的细胞会开始进行迁移活动,并且覆盖整个无细胞的区域,重新互相接触在一起。
 
 
传统实验方法
     细胞在培养皿内贴壁后,使用移液枪的枪头在贴壁细胞的中间划过,人为造成一道伤口(划痕),之后定时测量划痕的宽度,进而得到伤口愈合的细胞迁移数据
 
实验缺点:
1.手动划痕不能保证每次划痕的一致;
2.有时候在划细胞的同时会刮坏一片细胞对划痕的边缘的细胞造成机械损伤
3.如果培养皿底部还有包被蛋白的话,枪头划过,很可能伤害到包被,进而影响到细胞迁移,结果便很难判断是哪个因素造成了决定性的影响。
4.定时测量划痕的宽度,计算划痕宽度随时间推移的变化;在选取划痕测量点时,不可避免地引入了主观误差(人为选取了迁移结果符合实验预期的点);
 
       综上,传统的伤口愈合方法总是重复性不佳,对于实验结果的阐述说服力不足。
       下面分享一种新方法,轻松得到笔直均一的划痕!
 
实验核心
       使用伤口愈合插件制造笔直均一的划痕(图一)。

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实验方法     
一.实验材料
1) 细胞:     MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ: ACC115)
2) 实验耗材:   ibidi 35 mm培养皿带伤口愈合插件(ibidi, 81176) ibiTreat
3) 细胞培养基:  RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)
4) 细胞消化试剂:  Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)
5) 灭菌镊子
6) 倒置显微镜,如果需要进行连续的观测搭配镜载加热孵育系统
 
一.实验步骤
1.铺细胞(图
为了获得更好的实验结果,在做实验之前进行一次预实验,以确定需要使用的细胞悬液的密度。我们建议,将细胞悬液密度调整为24小时后正好可以长满每个插件的小孔。
● ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。
● 准备细胞悬液,调整悬液浓度为3*10cells/ml,这样24小时后,细胞能刚刚长满单个小孔。
● ibidi细胞插件的每孔中加入70μl的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。
● 37C培养箱中孵育24小时。

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        图A. 去除培养皿底部的保护胶带。B.C.ibidi伤口愈合插件中加入细胞。

 1.形成划痕
当所有细胞都贴壁并且刚刚长满的时候,就可以开始伤口愈合实验了。用镊子将伤口愈合插件提出,之后加入新鲜的培养基,或者在培养基中加入刺激剂,然后观察伤口愈合的情况。
       ● 24小时后对细胞前一天种的细胞做镜检。细胞要贴壁并且是刚刚长满每个孔。长得过多移除插件时会带走很多细胞,长得过少,伤口愈合的效果很差。
       ● 如图所示,小心的用镊子夹住插件的一个角,将插件移除。
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                                                        图三:用镊子移除插件
 
● 移除插件后,要用显微镜检查是否形成合格的划痕(图)。
● 小心的清洗细胞,之后加入2ml培养基进行培养。
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                                               图四 笔直均一的划痕
 
1.采集并分析图像
一般伤口愈合实验都是采集一张划痕的初始图像,再在实验结束时候采集一张划痕愈合的图像。我们建议可以在这个过程多做几个时间点,这样可以观测到细胞迁移随时间的变化特征。
● 在显微镜下选取能同时看到划痕和两边细胞的视野进行成像,划痕的方向在视野内为水平或者垂直
● MCF-7细胞每半小时采集一张图片,一直持续到20小时。
● 采用ibidi伤口愈合分析软件,统计细胞的覆盖面积,做出曲线图,可以看到在大约11个小时的时候,细胞基本就已经长满了,接下来几个小时细胞覆盖面积都不会发生变化(图)。

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                              图五(a)  显微镜下观察细胞覆盖面积的变化

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                                                图五(b)  细胞覆盖面积的数据统计

 
 
实验总结对比
1.本实验方法能得到重复性更好的划痕(图六);
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 图六 通过计算划痕的面积可以看出,在多次实验中,枪头划痕(左图)制造的划痕面积数据波动大,重复性差;ibidi伤口愈合插件(右图)制造的划痕面积数据统一,重复性良好
2.不会刮坏细胞,也不会造成划痕的边缘的细胞机械损伤
3.不会伤害到培养皿底部包被蛋白
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图一:左图表示枪头划过后,底部包被蛋白被划伤,细胞迁移结果受到底部不均一的影响。右图ibidi插件移除后底部的包被蛋白没有被破坏。
 
4.通过计算细胞覆盖面积得出细胞迁移结果,避免人为选取测量点,使数据更客观。1天内就能得到测量结果,实验分析更快更准确。

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