伤口愈合实验--神经生长因子(NGF)和神经生长因子前体(proNGF)会激活乳腺癌干细胞侵袭

  

伤口愈合实验是体外研究细胞迁移的的一个有用的实验。原理是人为的在铺板的单层细胞中制造一个空白的无细胞的地带,然后对这个无细胞地带的边缘的细胞进行观察;这些边缘的细胞会开始进行迁移活动,并且覆盖整个无细胞的区域,重新互相接触在一起。法国的科研人员在2015年的 STEM CELL上发的文章中提出神经生长因子(NGF)和神经生长因子前体(proNGF)会自动的激活乳腺癌干细胞,并且发生侵袭。文中,使用乳腺癌细胞系和肿瘤分离的细胞进行伤口愈合实验,得出,由NGF处理的肿瘤离的乳腺癌细胞的伤口愈合速率有非常显著的提高。说明在NGF能促进乳腺癌细胞迁移活动。
 
Nerve Growth Factor and proNGF Simultaneously Promote Symmetric Self-Renewal, Quiescence, and Epithelial to Mesenchymal Transition to Enlarge the Breast Cancer Stem Cell Compartment
E. Tomellini, Y. Touil, C. Lagadec, S. Julien, P. Ostyn, N. Ziental-Gelus, S. Meignan, J. Lengrand, E. Adriaenssens, R. Polakowska and X. Le Bourhis
STEM CELLS, 2015, 10.1002/stem.1849
 
在文中,使用Ibidi开发的伤口愈合插件进行了伤口愈合实验。这是一种双孔的硅胶插件,可以放在培养皿中,插件两孔间的孔壁宽度为500μm。将细胞种在插件中,等待细胞贴壁长满后,将插件移除,这样,两孔间的缝隙就是一个无细胞的划痕
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一.实验材料
1) 细胞:     MCF-7 、肿瘤分离细胞
2) 实验耗材:   伤口愈合插件培养皿 (ibidi, 81176) 
3) 细胞培养基:  MEM medium
4) 试剂:  EGF  sigma, E9644
           bFGF R&D233-FB
           NGF  Scil Protein
           proNGF Alomone LabsN-285
5) 灭菌镊子
 
一.实验步骤
1.铺细胞(图三)
● ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。
● ibidi细胞插件的每孔中加入× 104的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。
● 37C培养箱中孵育24小时。
 
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图三:A. 去除培养皿底部的保护胶带。B.C.ibidi伤口愈合插件中加入细胞。
 
1.形成划痕
● 采用无血清MEM培养基培养细胞4小时
● 如图四所示,小心的用镊子夹住插件的一个角,将插件移除。 
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● 移除插件后,要用显微镜检查是否形成合格的划痕
● 小心的清洗细胞,之后加入2ml培养基进行培养(图五)。
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1.采集并分析图像
● 在显微镜下选取能同时看到划痕和两边细胞的视野进行成像,划痕的方向好是水平或者垂直。
● 采集0h4h的图像,并且分析每张图的细胞覆盖划痕区的面积。
 
 
(三)实验结果
 
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如图所示,ML表示MCF-7 细胞系。肿瘤分离细胞团分别由EGFbFGFNGFproNGF处理,由t-EGF/bFGFt-NGFt-proNGF表示。可以看到由NGF处理的细胞,在4h的时候覆盖面积大,迁移速率快。

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