血管生成--甲状腺转录因子-1(TTG-1)影响肺癌细胞血管生成

  

美国的科研人员通过对TTF-1的调控发现,TTF-1能直接调节血管内皮生长因子(VEGF),并且发现VEGF启动子上有多处TTF-1响应序列。 比如,VEGF的主要受体,VRGFR2显示出收到TTF-1的直接正调节。本文中显示,低氧并没有促进 TTF-1+肺癌细胞中的VEGF的表达。而采用外泌体培养基或者是去外泌体的培养基(EDM)时,TTF-1都能促进VEGF表达。但在研究中意外的发现TTF-1+肺癌细胞的去外泌体培养基(EDM-TTF-1+)能够内皮细胞的血管形成。
 
研究人员采用HUVECs,铺在基质胶上,加入EDM以及VEGFR1等蛋白质后孵育2-3小时,对比不同条件下的分枝数和节点数。
 
Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome
L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu
Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857
 
(一)实验材料和实验方法
1)细胞:       HUVECs                                 104 cells/50μl
2)培养基:      RPMI
3)基质胶:    Basement membrane (Fisher Scientific, CB40234A)    10 µl per well
4) 试剂:     A549 conditioned media (EDM)
             Recombinant human GM-CSF protein250ng/mlPeprotech300-03
             sVEGFR1 protein20 ng/ml, RayBiotech,ELH-VEGFR1)
             Anti-GM-CSF antibody (R&D systems. MAB215)
             Anti-VEGFR1 antibody (R&D systems. AF321)
5)耗材:    ibidi血管生成载玻片  (ibidi, 81506)
6)其他:        细格纸                                   
           
 
(二)实验步骤
1)准备基质胶
① 10μlBasement membrane5mg/ml的浓度铺入ibidi血管生成载玻片的内孔中,注意枪头要垂直于内孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。
② 盖上ibidi血管生成载玻片的盖子。
③ 准备一个10cm的培养皿,放入浸过水的纸巾,制成一个湿盒。
④ ibidi血管生成载玻片放入培养皿中,盖上培养皿盖。
⑤ 37℃至少孵育30分钟,使基质胶完全固化。
图1.jpg 
 
怎么知道加了合适体积的Matrigel
由于Matrigel流动性不强,并且有可能移液枪不准确,有可能10μl的胶不能填满ibidi血管生成载玻片的下孔,这样,必然会影响到实验的成像结果。这时用一张格子纸就能知道移液枪调整到多少能正好把下孔填满。
图2.jpg 
如上图所示,垂直透过每个孔看下面的格子纸,如果格子被缩小了,那么就说明胶没加满,格子被放大了,那么胶就加多了,格子没发生什么变形,这才是刚刚加满下孔的状态。
 
图3.jpg 
3)铺细胞
 
① 在培养好的HUVECs细胞的60mm培养皿中加入5μ的 Calcein-AM,染色45分钟。
② 胰酶消化细胞制成悬液,每孔种10000个细胞即可。准备密度为2*105cells/ml的细胞悬液,充分混匀。
③ 将胶已经凝固的ibidi血管生成载玻片从湿盒中取出。
④ 每孔加入50μl的细胞悬液,注意保持枪头垂直在上孔的上方,不要接触下孔的凝胶。可以使用排枪。
⑤ 同样用格子纸查看是不是加了足够量的液体,如果没有,加入无细胞的培养基,使上孔液体正好加满。
⑥ 盖上盖,静置,一段时间后,所有细胞都会沉下去落在Matrigel的表面。
图4.jpg 
4)不同培养基处理
采用EDM-EVEDM-HDDEDM-TTF-1处理细胞,并分别加入 rGM-CSFrsVEGFR1,以Goat Ab和 Mouse Ab作为对照。37℃,培养2-3小时。
5)采集图像并统计结果
使用尼康TS100显微镜的40倍镜采集图像,并且用 ImageJ对其分枝数和节点数进行测量和统计。
 
三)实验结果
图5.jpg 
 
如图所示,使用EDM-TTF1处理的HUVECs血管生成被显著的抑制。当加入GM-CSFVEGFR1后,血管生成也被显著的抑制,但当加入GM-CSFVEGFR1的抗体后,血管生成的抑制也被取消,细胞又显出很强的血管生成结果。说明TTF-1上调了GM-CSFVEGFR1的表达,抑制了血管生成的进程。

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