卡西波肉瘤相关的疱疹病毒感染间充质干细胞分化组织表现出明显的血管生成、侵袭等现象

  

卡西波肉瘤是一种发生在包括口腔在内的多种组织内的,具有强的血管生成能力和侵袭能力的恶性肿瘤。卡西波肉瘤KS已经被鉴定出多种细胞标记物,但是其来源依然是一个迷。美国的科学家之前发现卡西波肉瘤相关的疱疹病毒(KSHV)能够使大鼠的原代间充质干细胞(MSCs)感染,变形,并且重新编辑,使其分化为类卡西波肉瘤细胞。在这次的实验中,科研人员使用KSHV感染由多种组织来源的人原代间充质干细胞,包括骨髓(MSCbm),脂肪组织(MSCa),牙髓,牙龈组织(GMSC),和乳牙。科研人员成功的建立起来KSHV感染的MSCaMSCbmGMSCLTC-KMSCs)的稳定株。其中,这些细胞表达了混合的KS标记物,并且显现出不同的血管生成、侵袭和变形的现象,而LTC-KMSCs表现出比未感染细胞更低的增殖率。进而研究人员发现KSHV介导的血管生成是通过KSHV介导的microRNA激活了AKT通路。这些研究说明,在人体内MSCsKSHV的靶细胞,会建立起多种KSHV感染的模型。
 
研究人员采用各种MSCs,铺在基质胶上,孵育8小时,对比不同细胞的分枝数和节点数。
 
Thyroid Transcription Factor 1 Reprograms Angiogenic Activities of Secretome
L. Wood, N. Cox, C. Phelps, S. Lai, A. Poddar, C. Talbot and D. Mu
Scientific Reports, 2016, 10.1038/srep19857
 
(一)实验材料和实验方法
1)细胞:  MSCs     ScienCell Research Laboratories (Carlsbad, CA) or Lifeline Cell Technology (Frederick, MD)
2)培养基:      MSC medium         (MSCM; ScienCell Research Laboratories)
3)基质胶:    Matrigel Basement membrane       (BD)    10 µl per well
4)耗材:    ibidi血管生成载玻片  (ibidi, 81506)
5)其他:        细格纸                                  
 
(二)实验步骤
1)准备基质胶
① 10μlBasement membrane5mg/ml的浓度铺入ibidi血管生成载玻片的内孔中,注意枪头要垂直于内孔的正上方加入Matrigel,防止有Matrigel流经上孔而留下残留胶。
② 盖上ibidi血管生成载玻片的盖子。
③ 准备一个10cm的培养皿,放入浸过水的纸巾,制成一个湿盒。
④ ibidi血管生成载玻片放入培养皿中,盖上培养皿盖。
⑤ 37℃至少孵育30分钟,使基质胶完全固化。
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怎么知道加了合适体积的Matrigel
由于Matrigel流动性不强,并且有可能移液枪不准确,有可能10μl的胶不能填满ibidi血管生成载玻片的下孔,这样,必然会影响到实验的成像结果。这时用一张格子纸就能知道移液枪调整到多少能正好把下孔填满。
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如上图所示,垂直透过每个孔看下面的格子纸,如果格子被缩小了,那么就说明胶没加满,格子被放大了,那么胶就加多了,格子没发生什么变形,这才是刚刚加满下孔的状态。
 
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3)铺细胞
 
① 每孔种10000个细胞即可。准备密度为2*105cells/ml的细胞悬液,充分混匀。
② 将胶已经凝固的ibidi血管生成载玻片从湿盒中取出。
③ 每孔加入50μl的细胞悬液,注意保持枪头垂直在上孔的上方,不要接触下孔的凝胶。可以使用排枪。
④ 同样用格子纸查看是不是加了足够量的液体,如果没有,加入无细胞的培养基,使上孔液体正好加满。
⑤ 盖上盖,静置,一段时间后,所有细胞都会沉下去落在Matrigel的表面。
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4)采集图像并统计结果
37度 5% CO2孵育8小时后,使用尼康Eclipse E400荧光显微镜采集图像,并其分枝数和节点数进行测量和统计。
 
三)实验结果
 
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对比LTC-KMSCs几种细胞的成管效果。Mock是未被病毒感染的间充质干细胞,KSHV会增强血管形成效果。图像是铺细胞后8小时采集,100倍放大倍数。
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(A)为了研究KSHV相关的miRNA的作用,对比了未被感染MSCsMock),感染的MSCsKSHV)和用10pre-miRNA簇缺失的突变病毒感染的MSCs(ΔmiR)和用这一突变的KSHV稳转的MSCs(ΔmiR Vector);以及用逆转录病毒重新表达这10miRNA簇(ΔmiR Cluster)这几组细胞的血管生成。发现这几个miRNA对于细胞的血管形成有着非常重要的作用。(B) LY294002一种磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的抑制剂,对于LTC-KMSCa血管形成有明显的抑制作用。并且随着LY294002浓度的上升,抑制作用会增强。两组结果均是铺细胞8小时后以100倍放大倍数采集图像。

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