可视的细胞趋化实验--内皮细胞对纤溶酶原激活物和抑制物的趋化响应

  

细胞趋化性(Chemotaxis,亦被称为化学趋向性)是趋向性的一种,指细胞、细菌及其他单细胞、多细胞生物依据环境中某些化学物质而趋向的运动。趋化性对细胞的发展和其他正常功能一样不可或缺。
在生物材料移植的时候,快速的纤维血管化是成功移植的先决条件之一。尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)或纤溶酶原激活物抑制剂-1PAI-1)在纤维蛋白溶解中都发挥了重要的作用。这三种蛋白近期均被报道在无可溶纤维蛋白的细胞过程中有表现出独特的作用,比如细胞粘附,迁移和增殖。
德国的科研人员发现使用内皮细胞做趋化实验,发现uPAtPAPAI-1对内皮细胞的趋化迁移行为都有显著的影响。
 
 
Components of the plasminogen activation system promote engraftment of porous polyethylene biomaterial via common and distinct effects.
Reichel CA, Hessenauer ME, Pflieger K, Rehberg M, Kanse SM, Zahler S, Krombach F, Berghaus A, Strieth S.
PloS one, 2015, 10.1371/journal.pone.0116883
 
 
一、实验材料准备:
 
倒置显微镜,具有4X相差物镜和定时拍照功能(Nikon
镜载加热孵育系统(375%CO2
可选配置:全自动载物台,自动对焦系统
分析软件:手动分析软ImageJ的“Manual Tracking”模块和ibidi公司的“Chemotaxis and Migration Tool” 进行数据统计分析。
HUVEC 细胞  (Human umbilical vein endothelial cells from Promocell
tPAuPAPAI-1 Sino Biological
Matrigel Corning
ECGM培养基 (Promocell
细胞趋化载玻片(图一)        (ibidi
图1.jpg 
图一,ibidi 细胞趋化载玻片图示,如图所示,细胞种在中间通道,两边的储液池可以放不同的刺激因子,从中间通道的观测可以得到细胞对刺激因子的趋向性,本例是使用一边加入uPAtPAPAI-1,另外一边放入培养基作为实验组,两边都放培养基作为对照组。
 
 
二、细胞趋化实验
 
 
1)实验步骤
 
将细胞与30%MatrigelECGM稀释液混合,密度为3×10cells/cm2,直接加入ibidi细胞趋化载玻片的中间通道中(图二)
图2.jpg
 
 
                 图二,在观测通道中加入细胞-基质胶混合液
 
将细胞趋化载玻片放入培养箱中30-35分钟,等待胶凝结
胶凝结后后分别在两边储液池中加入60μl30 ng/mLuPA20 ng/mLtPAμg/mLPAI-1和无化学趋化物培养基作为细胞趋化实验(+/-)(图三)
图3.jpg
      图三:加入X-lkd IIIA4抗体(红色)和无化学趋化物培养基(蓝色)
 
在两边储液池中均加入60μl的无化学趋化物培养基作为空白对照(-/-)或均加入趋化因子为阳性对照(+/+)(图四)
图4.jpg
     图四:加入无化学趋化物培养基(蓝色)作为空白对照
 
按说明,将通道加液孔塞紧后可以进行图像采集
将载玻片置入镜载加热孵育系统中,调整好采集位点,进行20小时的观测,每10分钟采集一张图片
 
三、图像数据处理
1)手动细胞轨迹追踪
下载ImageJ,并安装Manual Tracking模块
导入采集的系列图像到ImageJ中,打开模块“Manual Tracking”,选择“Add track开始记录细胞轨迹
选择一个细胞,按照时间点单击细胞,第一点击后,会有新窗口跳出来显示初始位置,以后每次点击,都将在这个新窗口中产生一个该细胞随着时间的新坐标
统计完足够的细胞轨迹后,保存轨迹坐标表格
至少收集30个细胞的轨迹才具有统计学意义,避免同一细胞追踪两次,去除由于凋亡会而不能采集完整的轨迹的细胞
 
四、实验结果:
 
 
 
图5.jpg
图6.jpg
 
图五:uPAtPAPAI-1对内皮细胞的趋化迁移行为的影响。A)为在趋化因子存在下,HUVEC细胞的趋向性运动轨迹。B)为统计分析结果说明,HUVEC细胞对uPAtPAPAI-1都有证趋向行为。

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