ibidi成像产品概述

      ibidi为肿瘤相关研究提供解决方案!

 

德国易必迪ibidi公司成立于2001年,位于马丁雷德,邻近慕尼黑。公司自成立以来,专注于细胞培养及功能实验的耗材及仪器开发(见图1),致力于为科研工作者提供操作简单、能够快速获得实验结果的高品质产品,在美国及欧美生物医学领域收到欢迎,在国内,ibidi产品设计及其优良的产品性能也使其逐渐获得相关科研工作者的关注与信赖。

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1. ibidi部分产品展示

利用易必迪公司ibidi提供的系列产品,可以从细胞和分子水平上对肿瘤的发生、发展、侵袭与转移等过程进行研究。下面以研究P蛋白在结肠癌发生发展中的作用为例,探讨ibidi公司系列产品从免疫荧光检测,到功能实验测定细胞增殖、分化、凋亡、迁移及血管生成等与肿瘤发生发展密切相关的生物学行为中的应用。

 

P蛋白在结肠癌病人中高表达,并且与肿瘤大小及淋巴结转移正相关。对于可能在肿瘤发生发展中起作用的特定蛋白分子,通过免疫荧光技术检测其细胞内表达及定位,通常是研究的第一步。P蛋白是一个功能未知的新蛋白,我们首先制备了分别针对N端、C端及多个功能域的抗体,通过Western blotting和免疫荧光实验来确定其表达及在细胞内的具体定位(图2)。由于ibidim-slide所需细胞数、抗体量等都非常少,同时可以很方便地在同一片slide上进行细胞培养、固定、染色等操作(见图2A),我们同批次在多个结肠癌细胞系中,利用自己制备的5个针对不同区域的抗体检测了P蛋白的细胞内表达及定位,发现P蛋白在结肠癌细胞系中普遍高表达,主要定位在细胞质中,在细胞核周围有聚集,核内也有少量信号(见图2B)。

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2. 蛋白P的细胞内定位。 A)实验流程示意图。将结肠癌细胞系Caco29000个细胞/孔的密度种植在ibidim-slide中,培养两天后,在m-slide中直接固定细胞,孵育一抗(抗P蛋白)和荧光二抗,封片后在共聚焦显微镜下观察。B)利用针对P蛋白不同区域的多种抗体进行免疫荧光实验,均提示内源P蛋白特异性地定位在细胞质。右边的免疫荧光图红色荧光显示的是P蛋白的细胞内定位,绿色荧光(Na-K-ATPase)显示的是细胞膜,蓝色荧光(DAPI)显示的是细胞核。

 

为了进一步了解P蛋白在肿瘤发生发展中可能的作用,我们一方面通过MTT实验检测抑制P蛋白对结肠癌细胞增殖的影响。结果发现,利用siRNA 降低P蛋白的表达显著抑制Caco2细胞的增殖,而且这种抑制作用可以被外源表达的RNAi resistant P蛋白所挽救(rescue)。另一方面利用经典的伤口愈合实验(也称划痕实验)我们检测了P蛋白的表达水平是否对细胞迁移有影响(图3)。我们选用ibidi culture-insert产品代替传统的枪头划痕方法,主要是基于ibidi生物相容性硅胶制成的插件,可产生确定的500μ“划痕”区域,“划痕”区域规整,配合配套的软件分析方便获得可靠的统计结果,实验操作简单,而且增强了实验的重复性(图3A)。我们选择了在17小时之内的多个时间点观察细胞的迁移情况。发现P蛋白的缺失对细胞迁移有明显抑制作用(图3B-C)。

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3. P蛋白的缺失抑制了Caco2细胞的迁移。A)愈伤实验流程示意图。易必迪公司设计提供的愈伤实验体系,有标准化的实验流程和细胞培养器材:将5X104细胞种植在被culture-insertIbidi)分开的小室中,等细胞贴壁长满后,去除culture-insert,让细胞自由爬过中间的“cell free gap”(约500mm),在不同时间点镜下观察愈伤过程。B)显微镜下观察发现,RNAi P蛋白明显抑制细胞的迁移,细胞层的愈伤过程受到严重影响。CB图的定量分析显示,17小时后,对照组细胞层已经愈合超过90%,而P蛋白RNAi的细胞覆盖的伤口面积仅为对照组细胞的30%

 

肿瘤细胞向局部侵犯或远处转移是恶性肿瘤重要的特性之一。我们利用ibidi可视化的“transwell--ibipore 产品(见图4A)检测了P蛋白对结肠癌细胞侵袭的影响。ibipore产品有上下两个独立的通道(见图4B),两个通道overlap的区域由一个孔径大小均一的玻璃网筛隔离开(见图4C)。两个通道可以分别培养细胞,通过两种方式,细胞可以贴壁于玻璃网筛的上下两侧。在细胞侵袭实验中(见图4D),ibipore考虑到这一因素,采用两侧可以培养细胞的玻璃网筛的设计,可以检测细胞向上侧通道进行迁移的能力,进而巧妙的排除了重力作用对侵袭实验的影响,而且光学成像特性好,可以实时观察细胞的侵袭情况。配合ibidi流体剪切力系统以及加热孵育系统,可以在流动、剪切力条件下实时的观察细胞的侵袭以及迁移等实验。我们采用ibipore产品实时观察肿瘤细胞向上侧小室侵袭的情况,发现P蛋白Knockdown的细胞向上侧侵袭的能力显著低于野生型细胞(数据未展示)。

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4.可视化的细胞侵袭产品—ibiporeAibiporeibipore玻璃膜培养细胞的染色结果。图片背景为在ibipore玻璃膜上培养细胞的荧光染色结果,规则排布的白色圆点为玻璃膜的孔隙。Bibipore组成示意图,上下两个独立的细胞培养通道,中间overlap区域由孔径大小均一的玻璃网筛隔离开。C3μm孔径玻璃网筛。D)细胞侵袭应用举例。

 

为了进一步验证P蛋白在肠癌的恶性转化过程中的作用,我们构建了P蛋白被稳定敲除的HCT-116细胞。裸鼠成瘤实验结果证明,P蛋白表达被抑制后,HCT-116的裸鼠成瘤能力受到非常显著的抑制。

 

上述实验结果提示P蛋白的表达与结肠癌的发生发展有着密切的相关性。为了寻找其分子机理,我们通过microarray的方法检测P蛋白knockdown引起基因表达谱的变化,从而寻找P蛋白可能参与调控的下游基因。非常有意思的是,我们发现P蛋白影响了一系列与增殖、趋化及血管生成相关的基因。我们选择了改变显著,同时与肿瘤转移密切相关的CXCR4VEGF-A两个分子进一步验证。发现在结肠癌细胞中抑制P蛋白的表达,会明显降低这两个分子在mRNA及蛋白水平的表达。

 

CXCR4是趋化因子基质细胞衍生因子-1CXCL12)的特异受体,有报道称其与结肠癌的转移相关。由于P蛋白在结肠癌病人中与肿瘤淋巴结转移正相关,我们推测P蛋白可能通过调节CXCR4的表达而影响结肠癌的转移,因而通过趋化实验比较了P蛋白被敲除的CaCo2细胞及相应对照组细胞在CXCL12刺激下的迁移情况(图5)。我们利用ibidi chemotaxis3D进行了细胞趋化实验检测。ibidi chemotaxis3D可以进行2D或者3D的细胞趋化实验(将细胞种入图5A1”区域),在“2”“3”小室直接加入含有趋化因子的培养液,或者直接种入细胞,以研究细胞分泌物对“1”区域细胞的影响。1张板上3chambers的设计方便同时进行并行的对照实验,一次获得实验所需的所有结果(图5B)。配合ibidi的活细胞加热孵育系统监测(图5C),可以进行长时间稳定的细胞培养基成像。ibidi加热孵育系统独特的顶盖玻璃盖加热设计,使温度高于平板,在顶盖和培养板之间形成垂直温度梯度,有效避免培养液蒸发而影响细胞培养条件,以及培养皿盖冷凝而影响显微成像质量等问题。实验结果发现,对照组Caco2细胞向含有CXCL12的小室方向迁移(图5D),而P蛋白敲除的CaCo2细胞则向两边随机迁移(图5E)。

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5. P蛋白的缺失抑制了Caco2细胞向CXCL12刺激方向迁移。A)趋化实验设计示意图。CaCo2细胞种植在ibidi μ-Slide Chemotaxis3D中间的“1”区域。B)实验组的“2”中加含有CXCL12的培液,“3”中加普通培液;对照组的“2”和“3”中加同样的培液,之后用ibidi的活细胞孵育系统连续观察细胞的迁移情况。 BIbidi活体孵育系统示意图。Cibidi的温控系统和CO2补充系统保证了细胞的培养条件可以长时期保持稳定,孵育小室加热的顶盖则保证了镜下观察时不受冷凝水的干扰,成像质量优异。D)对照组Caco2细胞向含有CXCL12的小室方向迁移,而P蛋白敲除的CaCo2细胞则向两边随机迁移。E)细胞趋化运动结果定量分析。利用WimTaxis Image Analysis软件进行细胞运动轨迹追踪、分析。

 

P蛋白影响的另一个分子VEGF-A与血管生成密切相关,而血管新生在肿瘤的生长和转移过程中都起着至关重要的作用。P蛋白促进成瘤,那么P蛋白是否会通过促进结肠癌细胞分泌VEGF-A,而促进肿瘤的血管新生呢?我们采用ibidi研究血管生成的产品进行实验。ibidiμ-Slide Angiogenesis具有独特的双层孔洞设计,在图6A图中“黄色”孔洞加入Matrix gel,形成厚度均匀的胶平面,上层孔洞用来加入细胞培养液(粉色区域),所需细胞和试剂用量少。与传统方法相比较(图6B),ibidi产品可以轻松形成平整的胶平面,能够将细胞均匀的铺在Matrix gel上,方便观察统计血管新生形成的分支点、成环数量以及细胞占据的面积等参数。而传统方法往往形成凹形的胶平面,胶表面不平整,细胞分布不均匀,使得细胞成像及统计变得困难。而且ibidi配套开发的统计软件可以解放劳动力,只要将间隔采取的图像上传,就可以轻松获得统计结果(图6C)。我们检测了野生型CaCo2细胞及P蛋白敲除的CaCo2细胞的conditional mediaHUVEC细胞血管生成的影响,结果发现发现野生型CaCo2细胞的conditional media相比P蛋白敲除的CaCo2conditional mediaHUVEC细胞tube formation有明显的促进作用(图6D)。

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6. Caco2细胞的conditional mediaHUVEC细胞血管生成的影响。Atube formation实验设计示意图。Bibidi血管生成产品优势:与普通96孔板相比,ibidi 的“μ-Slide Angiogenesis”所需细胞和试剂量很少,且能让所有细胞处于同一光学平面,提高成像质量。C)利用ibidi血管生成产品实验步骤简单,配合软件分析,轻松获得血管新生的统计结果。DHUVEC细胞种植在ibidi 的μ-Slide Angiogenesis中,加入野生型CaCo2细胞或P蛋白敲除的CaCo2细胞的conditional media,观察细胞tube formation情况。利用ibidi的活细胞孵育系统连续观察拍摄HUVEC细胞的tube formation情况,可以看到野生型CaCo2细胞的conditional media孵育的HUVEC细胞(upper pannel),相比P蛋白敲除的CaCo2conditional media孵育的细胞(lower pannel),其小管形成明显增多、密度更高。

 

综述所述,我们利用易必迪ibidi公司提供的系列产品,借助其优异的光学性能,标准化的实验设计,对P蛋白在结肠癌发生发展过程中的作用及其机理进行了系统研究,发现P蛋白在结肠癌细胞的增殖、迁移、成瘤等过程中起重要作用,并进一步寻找了其下游的作用分子,验证了P蛋白通过CXCR4VEGF-A在细胞定向趋化和血管生成中的关键作用。

 

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