date:2026-07-16 14:21:56
细胞系 Allen细胞科学研究所hiPSC系（AICS-0023/0024/0058-067），分别标记TJP1、MYH10、CTNNB1，可显示不同细胞参数。
关键耗材 μ-Slide 8 Well high μ-Pattern ibiTreat（ibidi，83813）；牛I型胶原蛋白（PureCol®，5005）；GFR Matrigel®（Corning，354230）。
培养基体系 以RPMI-1640为基础配制DE（含Activin A、bFGF、BMP4）、FP（含Activin A）和HB（含胰岛素、SB 431542、BMP4）培养基；以Advanced DMEM/F12为基础（含B-27、N2、HEPES、烟酰胺、A83-01、dbCAMP、EGF、HGF、R-spondin、FGF10）配制LP（加Jagged-1和视黄酸）和HepBili（加地塞米松和BMP4）培养基。
按照Allen研究所操作规程传代hiPSC，以 3×10⁵/cm² 接种于Matrigel包被的12孔板，使用mTeSR™ Plus培养至汇合。
| 第1–2天 | |
| 第3–5天 | |
| 第6–9天 |
图1.hiPSC向HB细胞分化。分化过程中人类诱导多能干细胞（iPSC，第0天）、前肠祖细胞（FP，第5天结束时）和肝母细胞（HB，第9天开始时）各阶段的相差显微镜图像。比例尺：20 µm。
将 1.5 mg/ml 牛I型胶原蛋白以 150 µl/孔 涂布μ-Slide，孵育30 min后PBS洗涤5次。第9天HB细胞经胰蛋白酶消化（37°C，3 min），淬灭培养基终止反应，180 g 离心5 min。用含 10 µM Y-27632 的HB培养基重悬，以 1×10⁵/cm² 接种于μ-Slide（≥300 µl/孔），37°C过夜培养。
| 第10–13天 | |
| 第14–23天 |
图2.在μ-Pattern ibiTreat上向肝胆细胞分化。直径500 µm微图案上肝母细胞（HB，第9天结束时）、肝祖细胞（LP，第13天结束时）和肝胆细胞（HepBili，第23天结束时）阶段的相差显微镜和荧光图像。AICS58 HB细胞表达mEGFP标记的CTNNB1，用于标记细胞间界限，有助于细胞分割。AICS23细胞表达mEGFP标记的TJP1，该蛋白标记顶端膜附近的紧密连接，可反映细胞极性。AICS24细胞表达mEGFP标记的MYH10，该蛋白标记肌动蛋白IIB，可用于推断细胞特异性收缩性。比例尺：200 µm。
将HepBili培养基、DPBS、10×DPBS、NaOH和牛I型胶原蛋白按32:6:1:1:8的比例混合，配制I型胶原凝胶，以150 μl/cm²（≥300 μl）覆盖于μ-Slide各孔中，37°C 过夜。次日加入HepBili培养基继续培养。覆盖胶原24 h后，细胞开始向凝胶内迁移并自组装形成管状结构，TJP1定位于顶端膜附近，界定管腔。本方案全程约23天完成分化，结合μ-Pattern 微图案化技术实现了胆管类器官的标准化构建，为胆道疾病研究和药物筛选提供了高效的体外平台。
本方案全程约 23天 完成分化，结合µ-Pattern微图案化技术实现了胆管类器官的标准化构建，为胆道疾病研究和药物筛选提供了高效的体外平台。
图3.在覆盖I型胶原24小时后，微图案上诱导形成的管状类器官。最大强度投影核（DAPI）、肌动蛋白（鬼笔环肽）和mEGFP标记的TJP1的相差显微镜图像及复合荧光图像。在覆盖胶原后，细胞开始向凝胶内迁移并形成管状结构。TJP1定位于顶端膜附近，界定了由肝胆细胞形成的管腔。比例尺，200 µm。
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