ibidi µ-Slide18孔载玻片

　　使用ibidi µ-Slide 18孔载玻片培养，固定和染色贴壁细胞的简单方案。在此示例中，我们培养了人内皮细胞，用低聚甲醛固定了它们，并对F-actin细胞骨架和表达α-微管蛋白的微管进行了染色。细胞核用DAPI复染。

　　该应用包括四个主要步骤：

　　准备实验材料如下：

　　详细步骤如下：

　　01培养

　　在无菌条件下打开ibidi µ-Slide 18孔ibiTreat（81816）的包装，并将其放在µ-Slide机架（80003）上。

　　准备细胞悬液（1 x 105cell/ ml），并在µ-Slide 18孔的每个孔中加100 µl。

　　用提供的盖子盖上腔室。

　　在潮湿的细胞培养箱（37°C，5％CO2）中培养过夜。对于更长的细胞培养，我们建议几天后进行中等程度的交换。

　　02固定，透化和封闭

　　使用移液器装置从孔中吸出细胞培养基。

　　用Dulbecco PBS冲洗细胞，方法是将100 µl缓慢加入每个孔。

　　用约100 µl 4％多聚甲醛固定细胞20分钟。

　　用PBS冲洗细胞两次，方法是将100 µl缓慢加入每个孔中。

　　除去液体，并在PBS中加入约100 µl的0.1％Triton®X-100。孵育10分钟。

　　用PBS洗涤细胞，缓慢将100 µl加入每个孔中。

　　除去液体，并在PBS中加入100 µl 1％BSA封闭溶液。孵育20分钟。

　　用PBS洗涤细胞，缓慢将100 µl加入每个孔中。

　　03染色

　　准备您的染色抗体溶液。

　　使用移液器装置从孔中吸出所有液体。

　　将100μlPBS稀释的一抗（抗-Tubulin 1：1000）稀释到每个孔中，并在4°C下孵育过夜。

　　用PBS洗涤细胞一次，持续10分钟。

　　将100 µl PBS稀释的二级抗体混合物（抗小鼠IgG-Atto594 1：500和LifeAct-TagGFP2蛋白30 µg / ml）稀释到每个孔中，并在室温下于黑暗中孵育3小时。。

　　用PBS洗涤细胞两次，每次10分钟。

　　吸出PBS，并在每个孔中加入约100 µl含DAPI的ibidi封固剂。使用滴管瓶滴加安装介质。

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　　04显微镜检查

　　在荧光显微镜下用合适的滤光片组观察细胞，可选择用ibidi浸油（50101）观察细胞。

　　（可选）覆盖图像以创建合并图像。

　　05结果

　　接种在µ-Slide 18孔，ibiTreat，物镜60x，24小时后的HUVEC（人脐静脉内皮细胞）。

　　绿色：F-肌动蛋白（LifeAct-TagGFP2蛋白）

　　红色：微管蛋白（单克隆抗α-Tubulin抗体，小鼠+抗小鼠IgG-Atto594）

　　蓝色：细胞核（使用具有DAPI的ibidi Mounting Medium进行DAPI染色）