活细胞成像是现代细胞培养中最引人入胜的技术之一。它不仅使我们能够像其他成像方法一样看到我们细胞的实时快照，而且是我们看到我们的细胞活动的唯一方法。了解它们如何移动、迁移，如何交流，如何进行细胞分裂，以及它们如何排泄、分泌、吞噬和进食。活细胞成像帮助我们了解生物过程。但与所有方法一样，在进行活细胞成像时需要注意一些事项，从细胞培养参数到技术方面，再到分析数据的最佳方法。

　　我们用活细胞成像来研究周围神经系统细胞（如神经细胞、Schwann细胞、神经元成纤维细胞）和用于组织重建的各种生物材料之间的相互作用。由于时间是神经再生的关键因素，我们对增强Schwann细胞的迁移潜力尤为感兴趣，Schwann细胞需要快速到达并桥接损伤部位以引导再生轴突。

　　强烈建议对细胞行为和过程感兴趣的每个人都使用活细胞成像进行研究。以下是我们提供的一些提示，可帮助您从一个全新的境界来了解您的细胞。

　　1、确保您拥有合适的细胞培养小室

　　首先，您需要确定哪些因素具有视觉意义。您只是想可视化您的细胞迁移吗？或者您是否想研究您的细胞是否将迁移方向改变为特定的生长因子？有多种细胞培养室可用于活细胞成像，特别是ibidi提供了各种完全适合您需求的选项。例如， µ-Slide Chemotaxis chambers 细胞趋化载玻片（图1）通过提供允许添加各种因素的细胞室来实现实时趋化性测量。细胞被接种在两室的中间，并且可以分析细胞优先地迁移到哪一侧。大多数情况下，我们使用µ-Slide 4 Well用于我们的活细胞成像实验，因为它们较大的区域允许在一个孔中观察多个位置。另一种选择是µ-Slide 4 Well ph+，它有一个特殊的中间挡板，可实现相差和高端荧光显微镜的出色图像。有许多不同的腔室可供选用，其中有一些我们还没有尝试过，但将来肯定会尝试。如果您有使用任何其他腔室载玻片的经验以及如何使用它们的，请告知我们！

图1) ibidi µ-Slide Chemotaxis

　　2、关于细胞：周密计划您的样品制备

　　接下来，重要的是要考虑如何准备细胞。根据细胞类型、移动速度和数量增长速度，需要确定各种参数。例如，Schwann细胞需要一些时间来沉淀，因此在接种后几小时开始活细胞成像实验是有意义的。此外，一些细胞往往会受到细胞间接触的影响，因此重要的是要考虑正确的细胞播种数，不同的研究的对象存在差异。因此考虑不同的细胞接种数量是很重要的。最后，决定细胞是否需要额外的包被也很重要。

　　3、让您的细胞在显微镜下保持活力和快乐

　　一旦细胞准备好，我们就可以去显微成像。不幸的是，并非所有显微镜都可用于活细胞成像。重要的是，它们得配备一个内置的培养箱，可调节CO2的浓度和温度，以保持细胞存活。我们将奥林巴斯 IX83 与ibidi Stage Top Incubation System加热孵育系统结合使用（见图 2）。它为我们提供了对温度和CO2以及湿度的精确控制。我们通常在 37°C 和 5% CO2、 50%湿度的恒定温温下进行活细胞成像实验。有两种不同的加热板可供选择，一种用于单腔载玻片，另一种用于一次对四个腔载玻片进行成像，非常适合大量实验。

图2) ibidi Stage Incubation System加热孵育系统

　　4、选择合适的显微镜和录制设置

　　把腔室载玻片固定在加热盖下的板上，就可以开始实验了。需要考虑的重要事项是显微镜的放大倍率、系统应该多久拍照一次以及拍摄多长时间。例如，由于Schwann细胞是快速移动的细胞，因此使用比成纤维细胞更低的放大倍数是意义的，成纤维细胞的移动速度要慢得多，迁移距离更短。我们使用cellSens Olympus Corporation软件每10分钟拍摄一张照片，持续至少10小时，这个是为与细胞速度和覆盖距离相关的迁移实验的而做的良好设置。如果您对细胞如何移动或对截然不同的事物感兴趣，例如细胞如何吸收粒子，则缩短拍摄照片之间的时间可能是有意义的。

　　5、通过分析数据量化实验

　　实验结束后，在我们的案例中，软件呈现的.vsi 文件，我们通常会将这些文件转换为.avi视频和.tiff 图像序列。然后，使用ImageJ，我们使用手动跟踪插件通过跟踪并单击每一帧中的单个单元格来跟踪选定的单元格。每个单元格都有单独的迁移路径。然后，使用 ibidi Chemotaxis and Migration Tool评估结果，该工具可以计算平均速度、平均总距离和有效距离，以及每个单元格的方向性指数（见图3）。

图3：ibidi Chemotaxis和迁移工具插件的界面

　　最后，您可以从中获得令人惊叹的数据：

　　参考：

　　F. Millesi, T. Weiss, A. Mann, M. Haertinger, L. Semmler, P. Supper, D. Pils, A. Naghilou, C. Radtke. Defining the regenerative effects of native spider silk fibers on primary Schwann cells, sensory neurons, and nerve-associated fibroblasts. FASEB Journal.2021,10.1096/fj.202001447R