date:2023-05-11 13:48:34
Ibidi 3孔/8孔/12孔可移除腔室载玻片
免疫荧光实验
ibidi提供了一种简单且经济高效的方案，使用一片可移除的腔室载玻片进行细胞的培养，固定和染色，无需爬片，是倒置/正置显微镜以及长期样品储存的理想选择。
本应用提供了一种使用ibidi8孔可移除腔室载玻片（80841）培养、固定和染色细胞的简单方案。培养MCF-7细胞并用福尔马林溶液固定。细胞核用DAPI染色，肌动蛋白骨架用DYE-490鬼笔肽染色。利用一级和二级抗体染色，通过免疫细胞化学可以探测其他细胞内结构。
实验使用的材料和试剂：
· 8孔可移除腔室载玻片（ibidi，80841）
· 可移除腔室载玻片用的盖玻片，24 x 60 mm（ibidi，10811）
· 细胞：MCF-7（CLS，300273）
· 细胞培养基
· 细胞培养试剂
· PBS缓冲液
· 福尔马林中性缓冲液，10％（Sigma，HT5011）
· 染色试剂
o DAPI（Sigma，D954）
o DYE-490鬼笔环肽（Dynomics，490-33）
· 封片剂：FluoroshieldTM（Sigma，F6182）
实验方案
细胞培养，固定，染色和成像观察--都是在一个开放型小室中搞定：）
步骤1：
必须在预实验中确定细胞系的正确接种浓度。根据您的细胞类型，用4-6x104细胞/ ml在2-3天内产生汇合的单层。
1.在无菌条件下，打开8孔可移除腔室载玻片（ibidi，80841）包装。
2.像往常一样用胰蛋白酶消化并计数细胞。细胞浓度为5×104细胞/ ml MCF-7。
3. 将400微升细胞悬浮液加入腔室的每个孔中。避免摇晃，因为这会导致细胞分布不均匀。
4. 用配套的盖子盖住。在37°C和5％CO2下培养。细胞至少培养24小时，或直到建立融合的单层。
步骤2：
固定是染色程序的第一步。目标是将细胞，细胞形成物或组织维持在其当前状态，并在较长时间内通过化学试剂保存。
1.小心地吸出细胞培养基。
2.用PBS洗两次。
3.加入400μl福尔马林溶液。
4.在室温下孵育30分钟。
5.小心吸入福尔马林溶液。
6.用PBS洗涤三次。
步骤3：
应根据感兴趣的细胞结构选择染色试剂。在该方案中使用DAPI和DYE-490鬼笔环肽染色MCF-7细胞的细胞核和肌动蛋白骨架。
1.准备你的染色溶液：
· PBS
· DYE-490鬼笔环肽
· DAPI 1μg/ml
2.小心吸出PBS。
3.移取400μl染色溶液到每个孔中
4.在室温下避光孵育30分钟
步骤4：
染色后清洗样本可最大限度地减少背景信号
1.小心地吸出染色溶液
2.加入400μl缓冲液
3.小心地吸出缓冲液
4.重复步骤2和步骤3至少一次
步骤5：
从一个边缘开始，用手或用镊子小心地取下硅胶垫圈。该步骤应以缓慢，稳定的进行，以避免损坏细胞层。
步骤6：
完成染色程序后，必须在用显微镜成像之前封固样品。该步骤还可防止样品脱水。
1.将载玻片侧面在干净的实验室湿巾上轻敲，去除样品中多余的介质。
2.将封固剂涂在样品上。用24 x 60毫米的盖玻片覆盖安装好的样品，小心地将盖玻片放到安装介质上，以避免夹住任何气泡。
Tip：建议使用硬化封片剂，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。
3.等封片剂固定好。
步骤7：显微观察
在可移除8孔腔室载玻片中免疫染色的MCF-7细胞的荧光显微镜检查。绿色：α-微管蛋白，红色：F-肌动蛋白（鬼笔环肽），蓝色：细胞核 (DAPI)。使用20倍物镜拍摄宽场荧光图像。
免疫荧光实验实例
人眼的小梁网细胞，在 ibidi 8 Well Chamber 8孔可移除载玻片中。F-肌动蛋白丝显示为绿色；细胞核被 DAPI（蓝色）染色。图片由中国香港香港理工大学视光学院的Samantha Shan提供。
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