相差显微镜的原理

　　……你是否经常使用相差显微镜来观察你的细胞？

　　……相差显微镜是如何工作的？

　　在这篇短片中，我们将向您展示：

　　……为什么这种显微镜技术对科学家如此重要?

　　……相位对比如何使几乎透明的细胞清晰可见?

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　　什么是相差显微镜（Phas Contrast Microscopy）?

　　相差显微镜是荷兰科学家泽尼克Zernike于1935年发明的，并于1955年获得诺贝尔物理学奖。相差显微镜是一种特殊的显微镜，特别适用于观察具有很高透明度的对象，例如生物切片、油膜和位相光栅等等。光波通过这些物体，往往只改变入射光波的位相而不改变入射光波的增幅，由于人眼及所有能量检测器只能辨别光波强度上的差别，也即振幅上的差别，而不能辨别位相的变化，因此用普通显微镜是难以观察到这些物体的。透明度很高的物体，也称为位相物体。相衬法（也叫位相反衬法）是通过空间滤波器将物体的位相信息转换为相应的振幅信息，从而大大提高透明物体的可分辨性，该方法使科学家能够以高水平的细节观察有机和生物样品，而不需要进行样品制备、染色或标记。所以从这个意义上说，相衬法是一种光学信息处理方法，而且是最早的信息处理的成果之一，因此在光学的发展史上具有重要意义。

　　相差显微镜和普通显微镜的区别是: 用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。

　　用途

　　相差显微镜主要用于观察未经染色的标本和活细胞。

　　基本原理：

　　相差显微镜利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅（光强度）的差别，经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现观测的显微镜。主要用于观察活细胞或不染色的组织切片，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。

　　相差显微镜把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜4个特殊之处：

　　1.环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。

　　2.相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种：

　　（1）A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。

　　（2）B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。

　　3.合轴调节望远镜 (centring telescope)：用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合。

　　相差显微镜有哪些优点？

　　相位对比显微镜的一个重要优势是可以自然地研究任何活细胞，而不需要固定、标记或染色。

　　该技术产生的所有图像可以是无标签的。这也为研究人员节省了时间，并减少了实验之间出现错误或变化的机会。

　　相位对比法对透明样品效果很好，因为额外的干扰使样品更加明显。在这种技术中，整个物体都被照亮了。

　　对于研究活细胞的细胞内成分，相衬显微镜提供了相对较高的分辨率。细胞线粒体、有丝分裂的染色体、空泡和其他活细胞成分都可以用这种方法来研究。

　　相差显微镜的组件也可以添加到几乎所有类型的光学显微镜中，只要相位物镜符合显微镜的管长参数，聚光器可以与正确尺寸的环形相位环联姻。这使得它成为一种灵活和广泛适用的技术。

　　相差显微镜要考虑的一个重要问题是什么？以及ibidi提供的解决方式是？