1.概述

　　在延时实验期间确保活细胞成像装置的机械稳定性非常重要。电动载物台的位置恢复中的振动效应或容差会导致图像序列的（轻微）偏移。每个外部运动都可以覆盖观察到的细胞运动。当使用更高的放大倍数或处理缓慢迁移的细胞时，这一点尤为重要，因为每个细胞所覆盖的距离相对较小。本应用说明将介绍一种计算外部引起的像素偏移的方法，然后将其从细胞轨迹坐标中减去。所得数据总结了实际的细胞迁移参数。

　　2.应用实例

图 1. 在实验过程中，stage top incubator位移产生了约90像素的永久像素偏移

　　图1显示了对图像序列中像素偏移进行校正的需要。在进行实验时，stage top incubator的位移产生了约90像素的永久像素偏移。绘制细胞轨迹（图2）和分析迁移参数（表1）给出了定向细胞迁移的错误印象。然而，将像素偏移纳入数据分析表明，明显存在的定向细胞迁移仅由像素偏移产生。

　　所给出的方法不仅适用于补偿一个大的像素偏移，而且也可以用于整个测量过程中可能发生的小偏移。

图2. 0到24小时内40个细胞的轨迹图。左图显示未校正数据，右图显示校正数据

　　表1. 未校正数据与校正数据偏移参数对比,获得的未校正轨迹值表明定向细胞迁移，即使这仅归因于现有的像素偏移。

　　3.原理

　　在图像序列中，校正像素偏移需要几个工作步骤：

　　1. 跟踪每次时间间隔测量的30到40个细胞。例如，我们建议使用ImageJ插件手动跟踪。该插件能够量化对象在时间堆栈的帧之间的移动。

　　2. 每个趋化室都需要一个参考轨道。必须在整个图像序列进行跟踪刚性点，例如通道边界的定义位置。当使用胶原纤维作为刚性点时，请确保不会因细胞运动产生的张力而发生纤维运动。参考轨迹的第一幅图像用作比较值（Xref,1 和 Yref1）。必须计算所有后续图像（Xshift,i 和Yshift,i）和比较值之间的像素偏移（Xref,i 和 Yref,i）。

　　3. 更正你的细胞轨迹。获得的每幅图像的轨迹坐标（Xi和Yi）必须通过计算出的像素位移进行校正。这是通过从原始数据细胞轨迹坐标中减去像素位移来执行的。因此，需要复制细胞格轨迹数据并将参考轨迹数据粘贴到同一个Excel文件中（图3）。

　　4. 将校正后的值复制到新的Excel文件中。此文件应另存为excel（.xls 或 .xlsx）和文本文档 (.txt)。exel文件允许进行后续更改，而文本文件可以导入趋化和迁移工具（ibidi提供的免费软件），用于绘制数据和分析趋化效应。

图3. 图像序列中小像素偏移校正的示例计算。计算每个参考图片的像素偏移并从原始数据中减去以获得校正后的轨迹坐标

　　5. 检查获得的值正确性。使用趋化和迁移工具打开原始以及更正后的跟踪文件，以检查您是否仅更正了数据，而没有错误地创建人工细胞运动（图4）。图4中显示的人工细胞运动归因于跟踪细胞时对像素偏移的延迟反应。与参考轨迹相比，这种延迟反应无法通过这种方法进行补偿。

图4 . 测试数据更正很重要。左图显示未经校正的原始数据，中间图显示像素位移校正数据，右图显示人工创建的细胞运动。