荧光肌动蛋白染色，特别是使用phalloidin，通过显微镜深入了解细胞结构和过程的一种强大方法。这种方法可以对肌动蛋白丝进行特定的可视化，使荧光肌动蛋白染色成为科学家解答许多与细胞生物学相关问题（包括细胞骨架组织和动力学）的不可或缺的工具。

　　本实验方案中，我们提出了一种使用µ- slide VI ^0.4六通道载玻片培养和对粘附性人纤维肉瘤细胞系HT-1080肌动蛋白荧光染色的简便方案。

　　请注意: 在开始肌动蛋白荧光染色之前必须检查几个重要的参数，如最佳细胞密度，理想的细胞培养器皿及底部/涂层。此外，阳性和阴性对照是验证染色的必要条件。因此，我们强烈建议在实验前进行充分的文献研究。

　　1. 材料

　　1.1. 试剂和缓冲液

　　细胞培养

　　• HT-1080细胞(85111505, Sigma Aldrich)

　　• 细胞培养基: DMEM (D6546, Sigma Aldrich)，含10%胎牛血清 (F1283, Sigma Aldrich)

　　• D-PBS (14190144, Gibco)

　　• Accutase (A1110501, Gibco)

　　荧光染色与成像

　　• D-PBS (14190144, Gibco)

　　• 福尔马林，10%，当即可用 (HT5011, Sigma Aldrich)

　　• Triton-X-100 (A16046, Thermo Fisher Scientific)

　　• 渗透性缓冲液 (0.1% Triton-X-100 in D-PBS)

　　• 牛血清白蛋白 (BSA) (A1470-10G, Sigma Aldrich)

　　• 封闭缓冲液 (1% BSA in D-PBS)

　　• Phalloidin溶液:1µl Phalloidin- ifluor 488 Reagent (ab176753, Abcam)在1 ml封闭缓冲液中

　　• ibidi封片剂，含DAPI (50011, ibidi)

　　• ibidi浸渍油 (50101, ibidi)

　　1.2. 设备

　　• µ-Slide VI^0.4 ibiTreat (80606, ibidi)

　　• µ-Slide支架 (80003, ibidi)

　　• 标准细胞培养设备(移液枪，超净工作台，细胞培养箱，培养瓶，细胞培养基，血细胞计等)

　　• 倒置荧光显微镜与适配的滤光片组

　　2. 方法

　　2.1. 细胞培养

　　在使用μ -Slide VI^0.4之前，请阅读使用说明书。在无菌条件下进行所有步骤。建议在细胞接种前一天将

　　µ-Slide VI0.4和细胞培养基放入培养箱中，以避免处理过程中形成气泡。在开始实验之前，在具有粘附细胞的标准底的细胞培养瓶（例如T75）中制备HT-1080细胞。理想情况下，在实验当天，细胞应该是低融合和健康的。

　　在整个过程中迅速工作是至关重要的，以防止细胞干涸。

　　如未另行说明，所有给定的体积都是单通道的，所有培养步骤都是在室温下进行的。

　　• 将10ml Accutase加入T75培养瓶中进行细胞分离；在培养箱（37°C，5%CO₂）中培养5分钟。

　　• 收集细胞悬液，离心，并将其稀释在少量细胞培养基中进行计数。

　　• 计数细胞，并在细胞培养基中调整到最终浓度为3 × 10⁵ cells/ml。

　　• 打开ibidi µ-Slide VI^0.4，并将其放在µ-Slide支架或合适的表面上。

　　• 将30µl HT-1080细胞悬液移液填充到每个通道中。快速填充有助于避免截留气泡。

　　• 通过倾斜µ-Slide通道载玻片并轻敲一侧边缘，清除通道中截留的气泡。

　　• 用随附的盖子盖上储液池。

　　• 将µ-Slide通道载玻片与支架放入培养箱(37 °C, 5 % CO₂)，让细胞附着 ( 1小时)。

　　• 在每个储液池中加入60µl无细胞细胞培养基。避免截留气泡。

　　• 将µ-Slide通道载玻片与支架放入培养箱(37 °C, 5 % CO₂)，并将细胞孵育过夜。

　　•  就延长细胞培养，建议每两天连续更换一次培养基(详见如下2.2)。

　　2.2.  连续更换培养基

　　• 小心地从储液池中抽吸培养基。不要从通道中吸入任何液体。

　　• 轻轻地将120µl无细胞培养基导入一个储液池中，使通道得以补充。

　　• 从对面的储液池中抽吸旧的培养基。使用细胞培养抽吸装置时要小心，因为这可能会吸走部分附着的细胞或细胞簇。

　　• 每个储液池使用60µl无细胞培养基重新填充储液池。

以最小容量为通道容量的三倍连续更换培养基

　　2.3. 固定, 透化和封闭

　　• 快速执行所有步骤，确保通道不会干涸。为实验准备足够的渗透缓冲液和封闭缓冲液。

　　• 通过连续的培养基交换用D-PBS代替细胞培养基进行洗涤。

　　• 抽吸大部分D-PBS。不要全部吸出。

　　• 用100µl福尔马林（10%）固定细胞20分钟。

　　• 连续换液，用200µl D-PBS洗涤细胞3次。

　　• 抽吸大部分D-PBS。不要全部吸出。

　　• 在100µl渗透缓冲液中孵育细胞5分钟。

　　• 用200µl D-PBS连续换液清洗细胞。

　　• 抽吸大部分D-PBS。不要全部吸出。

　　• 用100µl封闭缓冲液封闭20分钟。

　　• 用200µl D-PBS清洗细胞。

　　2.4.  染色

　　• 从储液器和通道中吸出所有D-PBS。使用5毫升注射器填充空通道，以尽量减少引入气泡的风险。

　　• 立即将30µl的phalloidin溶液加入通道中; 在暗处培养20分钟。样品应尽可能放在暗处保存。

　　• 连续交换培养基，用200µl D-PBS洗涤细胞2次。

　　2.5.  封片

　　•  吸取所有D-PBS，立即加入ibidi含DAPI的封片剂进行核染色，直到通道被填满。如果使用不同的封片剂，请注意它必须是非干燥的，以避免损坏µ-Slide。

　　•  在4°C暗处储存，直到成像。

　　•  染色后的µ-Slide可保存4周。理想情况下，应立即进行成像，因为较长的存储时间会降低图像质量。

　　2.6.  成像

　　•  在荧光显微镜下用适当的滤光片组观察细胞，必要时用ibidi浸渍油。

　　• 可选，叠加图像以创建合并图像。

　　3. 结果

　　HT1080细胞在µ-Slide VI ^0.4通道载玻片中的宽场荧光显微成像。使用phalloidin(绿色)观察F-actin细胞骨架。细胞核用DAPI（蓝色）染色。使用Plan Neofluar 40x/0.75物镜在蔡司Axiovert 135显微镜上进行成像。

　　您的荧光染色结果如果没有您预期的那样？请参阅 immunofluorescence troubleshooting guide