ibidi µ-Slide y-shaped通道载玻片是研究内皮细胞对剪切应力反应的强大工具。本应用说明提供了一种简化的方案：在µ-Slide y-shaped中培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC），施加受控的剪切应力，并进行免疫荧光染色。在本示例中，我们用Cy5®对HUVEC上的von-Willebrand-Factor因子（vWF）进行染色，用Alexa Fluor 488®对分化分子簇31（CD31）进行间接染色，并用DAPI对细胞核进行复染。

　　该方案主要包含四个步骤：培养→固定→染色→成像

　　1. 培养

　　• 无菌条件下，打开µ-Slide y-shaped（货号80126）置于µ-Slide rack载玻片支架（货号80003），通道内注入200μl HUVEC细胞悬液（密度1×10⁶/ml），移除储液池液体。

　　• 用随附的盖子盖住储液池口

　　• 将载玻片和载玻片支架架放入培养箱（37°C；5% CO₂）中，让细胞贴壁（约60分钟）。之后，向两个液池中各加入60µl无细胞培养基

　　• 继续培养≥3小时/过夜

　　• 连接ibidi Pump System泵系统（含灌注套件+流体单元+气压泵），在培养箱（37°C；5% CO₂）中进行流动培养。建议剪切力为7.5 dyne/cm²

　　• 使用11ml培养基时，需在3天内更换6ml培养基。

ibidi Pump System

　　2. 固定、透化和封闭

　　• 使用细胞培养吸液器吸除所有储液池中的培养基。缓慢向一侧储液池中加入1000µl杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS），同时从对侧的储液池中吸出液体，以此洗涤细胞。

　　注意：全程保持通道液体充盈，避免气泡和细胞脱落）

　　• 用约150µl含2%多聚甲醛的PBS固定细胞。20分钟后，向一侧储液池中加入约150µl含0.1% Triton® X-100（Fluka）的PBS，同时从对侧的储液池中吸出通道内的液体！确保通道始终保持湿润！

　　• 按照上述方法，用1000µl含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗涤细胞。

　　3. 染色和封片

　　• 预先配制好抗体溶液（本方案使用的浓度为：DAPI 0.1µg/ml；抗vWF（兔源）（Sigma）和抗CD31（鼠源）（Sigma）按1:1000稀释；抗兔（羊源）Cy5®（1mg/ml）（Invitrogen公司）按1:150稀释；抗鼠（鸡源）Alexa Fluor® 488（2mg/ml）（Invitrogen公司）按1:200稀释）

　　• 将200µl含DAPI（Sigma）的PBS和1% BSA加入通道中，在室温下孵育30分钟

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗涤细胞两次

　　• 将200µl含抗vWF（兔源）的PBS和1% BSA加入通道中，在室温下孵育45分钟

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗涤细胞两次

　　• 将200µl含抗CD31（鼠源）的PBS和1% BSA加入通道中，在室温下孵育45分钟

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗涤细胞两次

　　• 加入200µl 抗鼠（鸡源）Alexa Fluor® 488，在室温下孵育30分钟

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗涤细胞两次

　　• 加入200µl抗CD31（鼠源），在室温下孵育30分钟

　　• 洗涤细胞两次

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗涤细胞，然后加入200µl甘油（80%的PBS溶液，添加2% DABCO）进行封片和防淬灭处理*。载玻片可保存约4周。

　　4. 固定、透化和封闭

　　• 在荧光显微镜下使用适当的滤光片组观察细胞，并可选择使用浸油。

　　HUVEC细胞；绿色：CD31（血小板内皮细胞黏附分子 - 1）；红色：VIII因子（vWF）；蓝色：细胞核DNA。（蔡司Axiovert 135; Plan-Neofluar 40x/0.75）

　　* 参考文献：

　　Lee J.H., Koh H., Kim M., Kim Y., Lee S.Y., Karess R.E., Lee S.-H., Shong M., Kim J.- M., Kim J. & Chung J.; Energy-dependent regulation of cell structure by AMP-activated protein kinase. Nature Aug 2007; doi:10.1038/nature05828