前言

　　本应用说明介绍了一种在µ-Slide VI _0.4 µ-Pattern ibiTreat(cir200. pit600. hex)微图案六通道载玻片上培养、固定及染色细胞或细胞球状体的简单方案。ibidi µ-Patterns在ibidi Polymer聚合物盖玻片上提供空间定义的ibiTreat(组织培养处理)粘附微图案区域，周围区域环绕着生物惰性Bioinert(ULA)，以确保细胞仅在定义的微图案区域形成3D聚集体。

　　在此示例中，人肝细胞(Huh7)培养在多细胞阵列上，并用福尔马林溶液固定，F-肌动蛋白细胞骨架、α-微管蛋白和细胞核被标记用于荧光显微镜观察。

　　1. 实验材料

　　1.1 试剂与缓冲液

　　* 贴壁细胞，例如Huh-7(JCRB: #JCRB0403)

　　* 细胞培养基;例如，含10%胎牛血清(Gibco,10270106)的基础培养基RPMI-1640(Gibco,11875093)

　　* 磷酸缓冲盐溶液(PBS;14190144.Gibco)

　　* Accutase(A11105.Gibco)，或其他适合用于细胞收集的解离试剂

　　* 磷酸缓冲盐溶液(PBS;14190144.Gibco)

　　* 福尔马林，10%，即用型(HT5011.Sigma Aldrich)

　　* Triton-X-100(A16046.Thermo Fisher Scientific)

　　* 透化缓冲液(含0.5% Triton-X-100的PBS)

　　* 牛血清白蛋白(BSA)(A1470-10G,Sigma Aldrich)

　　* 封闭缓冲液(含1% BSA的PBS)

　　* 抗体稀释缓冲液(1% BSA和0.05% Triton-X-100溶于PBS)

　　* 鬼笔环肽-iFluor 488(ab176753.Abcam)

　　* 单克隆抗-α-微管蛋白抗体(T5168.Sigma-Aldrich)

　　* 抗小鼠IgG-Atto 594二抗(76085.Sigma-Aldrich)

　　* 含DAPI的ibidi封片剂(50011.ibidi)

　　* ibidi浸油2(50102.ibidi)

　　1.2 设备

　　* µ-Slide VI _0.4 µ-Pattern _{ibiTreat, cir200. pit600. hex} (83612. ibidi)

　　* µ-Slide Rack 载玻片支架(80003. ibidi)

　　* 标准细胞培养设备(移液器、无菌工作台、细胞培养箱、培养瓶、细胞培养基、血细胞计数板等)

　　* 具有相应滤光片组的倒置荧光显微镜

　　2. 实验步骤

　　2.1 细胞接种与培养

　　操作µ-Slide VI _0.4 µ-Pattern _{ibiTreat cir200. pit600. hex} 前请阅读说明书。所有步骤均需在无菌条件下进行。建议在接种细胞前一天将载玻片和细胞培养基置于培养箱中，以避免操作过程中产生气泡。在实验开始前，请将Huh-7细胞接种于标准细胞培养瓶(例如T75培养瓶)中，使细胞贴壁生长于瓶底。实验当天，细胞应处于亚汇合状态且状态良好。

　　整个操作过程中需快速进行，以防止细胞干燥。

　　除非另有说明，所有提及的体积均指每通道所需体积，所有孵育步骤均在室温下进行。

　　* 向T75培养瓶中加入10 ml Accutase用于细胞解离;在培养箱中(37 °C，5 % CO₂)孵育5分钟。

　　* 收集细胞悬液，离心，并用少量细胞培养基稀释以进行计数。

　　* 计数细胞，并用细胞培养基调整至最终浓度为0.5–3 × 106个细胞/毫升。

　　注意：根据所使用的细胞类型和实验需求优化细胞接种浓度。如需进一步了解影响细胞在ibidi µ-Patterns上附着的重要参数，请点击查看

　　Application  Note  65:  Cell  Adhesion  on  ibidi  µ-Patterns: Parameters and Optimization.

　　* 拆开µ-Slide VI _0.4 µ-Pattern _{ibiTreat cir200. pit600. hex} 载玻片，将其放置在µ-Slide载玻片支架或适当的表面上。

　　* 用移液器直接将30 µl细胞悬液加至每个通道中。快速加样有助于避免气泡滞留。对所有通道重复此操作。

　　* 如有必要，通过倾斜µ-Slide并轻敲其一侧边缘，去除通道中滞留的气泡。

　　* 用随附的盖子盖住储液池。

　　* 将载玻片连同支架放入培养箱(37°C，5% CO²)中，让细胞贴壁1小时。

　　* 向每个储液池中加入60 µl无细胞的细胞培养基。避免气泡滞留。

　　* 将载玻片连同支架放入培养箱(37°C，5% CO²)中，将细胞培养过夜。

　　* 如有必要，次日可用无细胞培养基洗涤以去除未贴壁的细胞和碎片。

　　* 对于长期细胞培养，建议每1-2天进行一次持续的培养基更换(见本文2.2 通道中的洗涤与持续培养基更换 )。在本示例中，细胞在图案上培养了10天。

　　2.2 通道中的洗涤与持续培养基更换

　　* 小心移除储液池中的培养基。吸液时远离通道，以防将通道内的液体一并吸出。

　　* 轻柔地将120 µl无细胞培养基加入一个储液池，以补充通道中的培养基。

　　* 吸出对侧储液池中的旧培养基。使用细胞培养吸液装置时需格外小心，以免冲走部分已贴壁细胞或细胞团。

　　* 每个储液池使用60 µl无细胞培养基进行补液。

　　Huh-7细胞在六通道载玻片ibiTreat µ-Pattern (200 µm circles, 600 µm pitch, hexagonal)上培养10天后的相差显微镜图像。比例尺=100 µm

　　2.3 固定、透化与封闭

　　* 所有步骤需快速进行，以确保通道不会干燥。吸液时避免直接从通道中吸取，以防将通道内的液体吸走。为实验准备足量的透化缓冲液和封闭缓冲液。

　　* 通过持续培养基更换，用PBS替换细胞培养基进行洗涤(见本文2.2 通道中的洗涤与持续培养基更换)。

　　* 吸出储液池中大部分PBS。切勿将整个通道内的液体全部吸干。

　　* 用100 µl福尔马林(10%)固定细胞20分钟。

　　* 通过持续培养基更换，用200 µl PBS洗涤细胞两次。

　　* 吸出储液池中的PBS。注意不要将通道内的全部液体吸干。

　　* 向其中一个储液池中加入100 µl透化缓冲液，孵育细胞5分钟。

　　* 通过持续培养基更换，用200 µl PBS洗涤细胞两次。

　　* 吸出储液池中的PBS。注意不要将通道内的液体全部吸干。

　　* 用100 µl封闭缓冲液在室温下封闭20分钟。

　　* 按照前述步骤，用200 µl PBS洗涤细胞两次。

　　2.4 染色

　　* 在抗体稀释缓冲液中稀释鬼笔环肽和抗-α-微管蛋白抗体(均按1:500稀释，或根据制造商的建议)制备一抗染色液。

　　* 通过持续更换，用100 µl一抗染色液替换通道中的封闭缓冲液，然后在避光条件下孵育过夜。

　　* 按照前述步骤用PBS洗涤两次。

　　* 在抗体稀释缓冲液中稀释二抗(1:500.或根据制造商的建议)制备二抗染色液。

　　* 用100 µl二抗染色液替换通道中的PBS，并在室温避光孵育1小时。

　　* 用PBS洗涤三次。

　　2.5 封片

　　* 吸出所有PBS(此时可吸走整个通道内的液体!)，并立即加入含DAPI的ibidi封片剂(ibidi Mounting Medium With DAPI)进行细胞核染色，直至通道充满。如果使用其他封片剂，请注意其必须为非干燥型，以避免损坏µ-Slide载玻片。

　　* 避光于4 °C保存直至成像。

　　* 染色后的µ-Slide可保存长达4周。但建议尽快进行成像，因为存放时间过长可能会降低图像质量。

　　2.6 成像

　　* 使用配备适当滤光片的荧光显微镜观察细胞，必要时可滴加ibidi浸油。

　　* 可选：叠加通道图像以生成合并图像。

　　3. 实验结果

　　Huh-7细胞在µ-Slide VI _0.4六通道载玻片中，贴附于ibiTreat µ-Pattern(200 µm circles, 600 µm pitch, hexagonal)微图案表面的宽场荧光显微镜图像。F-肌动蛋白细胞骨架通过鬼笔环肽(绿色)进行可视化。细胞核用DAPI染呈蓝色，微管蛋白呈红色。成像在尼康TiE倒置显微镜上使用4倍物镜进行。比例尺=100 µm。