当今，建立具有生理学相关性的体外组织和器官模型仍然是科学家的一大挑战。实现这一目标的重要一步，体现在众多新兴技术将3D培养平台与微流控技术相结合。事实上，微流控方法能够更好地重现生理条件，使细胞在“类体内 (in vivo-like)”环境中生长[1]。微流控的主要优势在于持续供应营养物质，同时清除代谢产物，这种动态过程有助于减少所需培养基和补充剂的用量 [2]。

　　VITVO® 是一款易于操作的3D细胞培养生物反应器。该装置由一个内部惰性合成基质构成，并封装在一个由两个透明氧合膜和一个带有进样口和出样端口的周边框架组成的结构中。VITVO基质允许多种细胞类型生长，包括共培养。其装置结构使得流体能够穿过其厚度，从而截留细胞。得益于VITVO的标准连接件，可以轻松建立一个实现3D动态培养的流体模型[3]。

　　市面上有多种泵系统。它们的不同特性使其适用于特定的实验要求。ibidi流体剪切力系统通过对充满培养基的储液器施加气压来产生流动。通过特殊的切换模式循环培养基，可以产生恒定的单向流动。这使其成为长期细胞培养中施加定义剪切应力的理想设置。使用ibidi流体剪切力系统，可以模拟连续和脉动层流，以及振荡流。

　　本文旨在评估VITVO生物反应器与ibidi流体剪切力系统（ibidi泵系统）之间的兼容性和协同作用，以开发一种精确定义的微流控应用，为3D动态细胞培养开启新的可能性（图1）。

图1. 整合ibidi流体剪切力系统和VITVO生物反应器的示意图

　　材料

　　• VITVO® 生物反应器 (Rigenerand srl)

　　• 2.5 mL注射器 (Becton Dickinson and Co)

　　• 人乳腺癌MDA-MB 231细胞系(DSMZ, ACC 732)

　　• DMEM/F-12培养基 (Gibco, 31330038)

　　• 人纤维肉瘤HT1080细胞系(DSMZ, ACC 315)

　　• 基础培养基DMEM (Gibco, 41965039)

　　• FCS (Gibco, 10270106)

　　• 胰酶/EDTA (Gibco, 15400)

　　• Laminin (BioLamina, LN521-02)

　　• ibidi Pump System流体剪切力系统(ibidi GmbH, 10902)

　　• Perfusion Set Blue灌流管套装(ibidi GmbH, 10961)

　　• NucBlue™ Live ReadyProbes™™ 试剂 (Hoechst 33342) (Life technologies, R37605)

　　方法

　　3D细胞培养建立：

　　一个VITVO基质用层粘连蛋白Laminin (60 µg/ml) 包被，并在37°C下孵育过夜。随后，MDA-MB 231细胞以300,000细胞/mL的浓度重悬于培养基(DM EM/F-12 + 10% FCS)中，并使用注射器注入包被后的VITVO基质内。同时，另一个VITVO接种HT1080细胞：该基质首先用预热的培养基（DMEM + 10% FCS）进行预处理，然后将300,000细胞/mL的HT1080细胞悬液注入装置内部。两种3D培养物都在37°C、5% CO²条件下孵育过夜，以使细胞贴附到纤维基质上，然后再连接到实验回路。

　　VITVO与ibidi流体剪切力系统的动态回路设置：

　　灌流管套装(Perfusion Set)采用无菌包装。为排出硅胶管和塑料部件中的气体，将灌流管套装连同包装一起放入培养箱中过夜。从包装中取出灌流管套装时，请将流体单元(Fluidic Unit)置于超净工作台内。将储液器插入流体单元的支架中，并检查适配器的密封性。在连接VITVO装置前，先进行初始的除气泡、夹管阀测试和流速校准。

　　连接VITVO到灌流管套装时，用软管夹夹住管路。取下端口1的封闭帽，将装置垂直放置，开口端口朝上。在开口端口处形成弯月面，以避免连接到灌流管套装的Luer接头时截留气泡。连接端口1后，翻转VITVO，重复上述步骤连接端口2。移除软管夹，并在连接好两个端口后重新校准流速。每个VITVO按照上述描述连接到灌流管套装，并放置在37°C、5% CO²的培养箱中培养7天（图2A）。

　　结果与讨论

　　MDA-MB 231和HT1080细胞在ibidi流体剪切力系统动态条件下成功于VITVO培养基中培养，灌流管路中施加的压力维持在5至10毫巴（图2A）。培养7天后，细胞经NucBlue Live ReadyProbes染色，并通过Nikon Eclipse Ti Orca Flash 4.0L显微镜搭配4倍物镜对3D细胞培养进行可视化观察。明场显微镜观察VITVO基质时仅能显示基质纤维（图2B左侧）； 细胞需经荧光标记或荧光染色方可显现（图2B右侧）。NucBlue染色结果表明两种细胞培养物在动态条件下均表现出良好增殖能力，这为根据实验的多种需求，设置ibidi流体剪切力系统和VITVO的定制配置提供了可能性。

　　图2. A)带有MDA-MB 231细胞（左）和HT1080细胞（右）的VITVO流体回路。B)灌流培养7天后NucBlue染色。宽场荧光显微镜，4x物镜

　　结论

　　VITVO生物反应器和ibidi流体剪切力系统可组合使用，建立适用于不同研究目的的多种3D动态培养体系。VITVO装置的多功能性支持多种细胞类型的体外培养，由此衍生出多种应用可能性。将ibidi流体剪切力系统与小型VITVO生物反应器结合使用，可开发出多种动态3D细胞培养模型，以更逼真地模拟体内环境中的间质流，同时实现对流速和剪切应力的精确调控。

　　参考文献

　　[1].Van Duinen V, Trietsch S J, Joore J, Vulto P and Hankemeier T. Microfluidic 3D cell culture: tools to tissue models. Current Opinion in Biotechnology. 2015, 35:118-126.

　　http://dx.doi.org/10.1016/j.copbio.2015.05.002

　　[2].Chen C, Townsend A D, Hayter E A, Birk H M, Sell S A, Scott Martin R. Insert-based microfluidics for 3D cell culture with analytical and bioanalytical chemistry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. DOI: 10.1007/s00216-018-0985-y.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0985-y

　　[3]. Candini O, Grisendi G, Foppiani EM, et al. A Novel 3D In Vitro Platform for Pre-Clinical Investigations in Drug Testing, Gene Therapy, and Immuno-oncology. Sci Rep. 2019;9(1):7154. Published 2019 May 9. doi:10.1038/s41598-019-43613-9.