Micro-Insert 3D在趋化性侵袭实验中的应用与优化

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Micro-Insert 3D在趋化性侵袭实验中的应用与优化

date:2026-03-23 11:45:11

理解细胞侵袭对于揭示肿瘤进展和免疫细胞迁移的机制至关重要，这两者都是疾病发展和治疗反应的核心。本方案描述了一种趋化性驱动的侵袭实验，使用3D自插式微孔插件 (micro-Inserts 3D for self-insertion)，插件内并填充I型胶原蛋白(collagen I)基质，用于评估Jurkat T细胞的迁移行为。

代表快速迁移淋巴细胞的Jurkat细胞被接种在胶原凝胶的顶部，并通过相邻储液池中不同浓度的胎牛血清（FCS）产生的血清梯度进行刺激。24小时后，通过成像和深度量化评估细胞向胶原基质内的侵袭情况。与化学均质环境中的细胞相比，暴露于FCS梯度的细胞显示出显著更深的侵袭，这与血清的绝对存在与否无关。

该设置模拟了3D环境中的趋化性侵袭，突显了方向性信号在促进细胞通过细胞外基质组分进行主动迁移中的作用。该方案提供了一个强大且可重复的平台，用于在生理相关条件下研究免疫细胞迁移和肿瘤微环境相互作用。

1. 实验材料

1.1 试剂和缓冲液

3D自插式微孔插件micro-Inserts 3D for self-insertion (80499, ibidi GmbH)
μ-Plate 24 Well, ibiTreat (82426, ibidi GmbH)
Collagen Type I, Bovine (I型胶原，牛源) (50303, ibidi GmbH)
Jurkat细胞(ACC 282, DSMZ GmbH)
RPMI 1640培养基(21875034, Gibco, Thermo Fisher Scientific)
胎牛血清(FCS, 10270106, Gibco, Thermo Fisher Scientific)
10× RPMI 1640培养基 (R1145, Sigma)
超纯水配制的NaOH (1 M)
NaHCO₃7.5% (S8761, Sigma)
无菌超纯水

1.2 设备

细胞培养箱(加湿，37°C，5% CO₂)
标准细胞培养设备(无菌操作台，细胞消化试剂盒，培养瓶，带合适吸头的移液器等)
冷却的铝珠或冰块

2. 实验步骤

每个实验需制备三种不同的样本，每种样本均设置三个重复：

1.梯度样品 (-/+)：仅在micro-Insert 3D的外侧孔中添加趋化因子（本例中为10% FCS）。

2.均一分布样品 (+/+)：整个样品（即外侧孔、内侧孔和凝胶基质中）均含有10% FCS。

3.无趋化因子样品 (-/-)：培养基和凝胶中均不添加FCS。

图1：三种实验条件的示意图（上：-/+，中：+/+，下：-/-）：细胞被接种在3D微孔插件内的3D胶原基质上。上（-/+）：在微孔插体的外侧孔中加入趋化因子溶液，并让细胞侵入基质1-3天（具体时间取决于细胞类型）。中（+/+）：在微孔插体的内侧和外侧孔中均加入趋化因子溶液（形成均一浓度环境）。下（-/-）：未加入任何趋化因子。

2.1 样本制备

将九个micro-Inserts 3D分别放入µ-Plate 24 well 24孔培养板的孔中。轻轻按压每个插件以去除截留的气泡，并确保其与表面牢固接触。
向培养板的空余孔中填充无菌水或PBS，以减少孵育期间的蒸发。

2.2 胶原凝胶制备

在开始制备凝胶前，请阅读I型胶原蛋白（Collagen Type I）说明书。

本实验需要制备两种胶原凝胶混合物：

不含血清(用于-/+和-/-样品)
含10%胎牛血清(FCS)(用于+/+样品)

重要提示：胶原凝胶的移液操作

进行胶原凝胶移液时，请务必使用预冷的移液器吸头(4°C)。

对于I型胶原凝胶的制备，由于凝胶粘度高，建议所有步骤均采用反向移液法。将移液器按压至第二压力点，使整个吸头充满凝胶。排液时仅需按压至第一压力点，虽然此时枪头内会残留少量胶原液（需弃去），但这种方法能确保排出的胶原体积更加精确。我们推荐使用Eppendorf Visco Tips或Gilson Microman E等产品。

请注意，即使在4°C下，凝胶混合物也最多只能在5分钟内使用，之后便会开始部分凝胶。

1.按照表1的配比，制备胶原混合液（1.5 mg/ml牛源胶原，含或不含10%血清）。请按表1所列顺序添加各组分，并用移液器充分混匀，操作时置于冰上以延缓凝胶化。

2.向每个micro-Insert 3D的内侧孔中加入20 μl混合液。为确保形成平整的胶原层，将移液器垂直对准孔中央进行加样。

3.盖上培养板盖子，将培养板放入培养箱中聚合约30分钟。

注意：如需便捷地计算不同胶原浓度，可直接使用ibidi官网提供的ibidi胶原浓度计算器(ibidi Collagen Calculator)。

表1：配制300 μl含或不含FCS的1.5 mg/ml I型胶原基质的移液方案

2.3 细胞接种

1.在凝胶聚合期间，按常规方法收集细胞。

2.制备两份细胞悬液，浓度为3 × 10⁵细胞/ml：

细胞悬液1：使用无血清培养基（用于 -/- 和 -/+ 样品）
细胞悬液2：使用含10% FCS的培养基（用于 +/+ 样品）

3.从培养箱中取出培养板，在显微镜下确认凝胶聚合情况。如果基质未完全聚合，可再孵育10-15分钟。

4.按以下方式向每个micro-Insert 3D的外侧孔中填充250 μl培养基：

对于 -/- 样品：使用无血清培养基
对于 -/+ 和 +/+ 样品：使用含10% FCS的培养基

5.向每个孔的凝胶基质上方加入25 μl相应的细胞悬液。注意避免移液器吸头触碰凝胶基质。

6.盖上培养板盖子，将培养板放回培养箱。让细胞侵入凝胶24小时。

3. 成像

1.24小时后，使用相差显微镜记录细胞在凝胶基质中的侵袭情况。

2.对于每个micro-Insert 3D插件中部选择三个随机的XY位置（胶原层平整处）。在每个位置采集一个z-stack，从凝胶顶部（细胞聚焦处）开始，一直扫描到孔的底部，Z轴步长为13 µm。

注意: 相邻图像之间的z间隔应大致等于单个细胞的直径（约8–15 µm），以确保最终图像堆栈中能捕获所有细胞。

图 2：在FCS梯度(-/+)条件下，Jurkat细胞浸润进入凝胶基质24小时的Z轴堆叠扫描（z-stack）代表性图像。在micro-Insert 3D内的同一位置，于不同Z平面上采集的相差显微镜图像。第一张图像（0 µm）显示细胞位于凝胶基质顶部。在随后的图像中，只有浸润到指定深度的细胞处于聚焦状态。图像使用Zeiss Axio Observer Z1显微镜配备40× LD Plan-Neofluar物镜拍摄。

4. 评估结果

为评估细胞对趋化因子FCS的侵袭响应，需为每个孔计算一个深度分数，该分数基于各z平面图像中处于焦平面的细胞数量，反映细胞向基质内的侵袭深度。

侵袭指数的计算方法为：将每个深度h处（nh）的（处于焦平面的）细胞总数乘以对应的深度h（单位为µm），并除以所有深度内细胞的总数（N）：

图3：Jurkat细胞在FCS梯度下的趋化驱动侵袭。柱状图显示平均侵袭指数。数据表示24小时后的平均值+SEM（标准误）(n = 2个独立实验，每个实验重复三次)。结果显示，与处于FCS浓度均一环境下的样本相比，暴露于FCS梯度的细胞向胶原基质内的侵袭深度显著更深。注：在本示例中，对于横跨多个层面（slices）的细胞，仅在细胞中心平面聚焦的层面进行一次计数。

5. 总结

这种使用micro-Insert 3D进行的趋化性驱动侵袭实验，为定量分析3D胶原基质中的免疫细胞迁移提供了一种可靠且具有生理相关性的方法。在不同血清条件下观察到的浸润深度差异，突显了方向性信号（directional cues）在细胞运动中的重要性。该方案非常适用于趋化行为的对比研究，并可针对其他细胞类型或趋化因子进行调整，从而探索细胞侵袭及微环境相互作用的多个维度。